目的 构建一种能同时在转录与翻译水平对脂解刺激脂蛋白受体(lipolysis-stimulated lipoprotein receptor, LSR)进行双重检测的报告系统,以实现对LSR表达和功能的精准监测。方法 采用规律间隔成簇短回文重复序列/规律间隔成簇短回文repeat序列相关蛋白系统9 (clustered regularly interspaced short pal-indromic repeats associated protein 9, CRISPR/Cas9)介导的基因敲入策略,在HEK293细胞LSR基因最后一个外显子终止密码子上游定点整合增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)和高斯荧光素酶(Gaussia luciferase, Gluc)编码序列,构建双报告基因系统。通过EGFP荧光信号实现LSR表达的实时可视化观察,借助分泌型Gluc的活性检测完成定量分析,并通过内源性LSR敲低结合蛋白质印迹法、免疫荧光染色及实时荧光定量PCR验证系统的可靠性。结果 成功建立的LSR-EGFP-Gluc敲入细胞系可准确模拟内源性LSR的表达与功能。EGFP荧光可实时反映LSR的动态表达,Gluc活性检测提供了高灵敏度、高特异性的定量读数。功能验证证实,该细胞系中LSR表达对内源性LSR敲低及蛋白合成抑制剂的应答符合预期规律。通过转录调控因子筛选,鉴定出固醇调节元件结合蛋白2(sterol regulatory element-binding protein 2, SREBP2)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ, PPARγ)为LSR表达的转录调控分子。结论 本研究构建的LSR双报告基因系统可互补监测LSR动态变化,兼具高灵敏度、准确性与多功能性。
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